EN CZ

KOCH

Biologicky aktivní terpenoidy

Biologicky aktivní terpenoidy.

Terpenoidy jsou rozsáhlou skupinou přírodních látek, které se vyskytují v živých organizmech, zejména v rostlinách, houbách, plísních a mořských živočiších. Mnoho z nich má rozličné biologické aktivity, z nichž můžeme jmenovat: protinádorovou, protivirovou, antibakteriální, virostatickou, antiulcerózní, protizánětlivou a mnohé jiné.1 Ve světové literatuře je popsána řada studií mechanizmů účinku terpenoidů, u řady sloučenin byl již i odhalen molekulární cíl, protein s nímž aktivní molekula interaguje a jehož inhibice je zodpovědná za danou biologickou aktivitu.

terpenoidy1

Obr. 1 Bříza bělokorá (betula pendula), zdroj betulinu.

Ve spolupráci týmů Dr. Šarka, Dr. Urbana a doc. Hajdúcha se v naší výzkumné skupině řadu let věnujeme zejména derivátům kyseliny betulinové, jež tvoří až jedno procento kůry platanů, a betulinu, kterého je až 10 % v kůře bříz. Chemickou modifikací těchto derivátů byla získána chemická knihovna více než 1000 nových sloučenin, z nichž řada vykázala selektivní cytotoxickou aktivitu vůči nádorovým buňkám v mikromolární nebo dokonce submikromolární koncentraci.2,3,4 Řada těchto sloučenin byla patentována5 a u nejlepších z nich byly prováděny pokusy o stanovení mechanizmu účinku. Zajímavé výsledky vykázala sloučenina s doposud nejnižší zjištěnou hodnotou IC50, pracovně nazvaná “JS8,” u níž předpokládáme interakci s cytochromem c, která blokuje dýchací řetězec v mitochondriích, což v konečném důsledku vede k rychlé a selektivní apoptóze nádorových buňek. U jiných derivátů byla v rámci předběžných výsledků prokázána inhibice proteasomu a z literatury je známo několik dalších molekulárních cílů derivátů kyseliny betulinové, např. topoisomeráza I,6 HIV-1 GAG protein.7

terpenoidy2

Obr. 2: Betulin, kys. betulinová, JS8 a příklad nového cytotoxicky aktivního derivátu. Pro bližší seznámení s více strukturami doporučujeme nahlédnout do literatury na konci a na webových stránkách katedry.

terpenoidy3

Obr. 3: Platan javorolistý (platanus hispanica), zdroj kyseliny betulinové.

Z uvedených dat vyplývá, že triterpeny mají řadu biologických aktivit a jejich mechanizmus účinku není univerzální, lze tedy očekávat, že mají mnoho různých molekulárních cílů. Tyto informace jsou stěžejní pro další směřování výzkumu našeho pracoviště, které je možno formulovat pomocí následujících cílů:

  1. Syntetizovat nové triterpenoidní deriváty. Metodami klasické i moderní organické chemie syntetizujeme nové sloučeniny z výchozích terpenů a zjišťujeme jejich cytotoxickou aktivitu. Nové struktury navrhujeme obvykle racionálně na základě výsledků biologického testování ve snaze nalézt lepší inhibitory růstu rakovinných buňek. Často také spojujeme triterpeny s jinými molekulami, které by měly být schopny buď zvýšit jejich cytotoxicitu, zlepšit  biodostupnost nebo zavést zcela novou vlastnost, např. fluorescenci. K modifikaci se nejlépe hodí kruhy A a E (viz obr. 2).
  2. Optimalizovat farmakologické vlastnosti známých aktivních látek. U mnoha objevených derivátů jsme pozorovali nepříznivé farmakologické vlastnosti, které mohou negativně ovlivnit další testování, zejména in vivo, biodostupnost apod. Jedná se hlavně o rozpustnost ve vodných médiích. Z tohoto důvodu syntetizujeme rozličné prodrugs, jejichž farmakologické vlastnosti jsou příznivější a také hledáme vhodné farmakologické formulace, které umožňují triterpenoidy rozpustit.
  3. Syntéza knihoven a použití syntéz na pevné fázi a kombinatoriální chemie. V současné době pracujeme na vývoji metod, jak pomocí syntéz na pevné fázi a kombinatoriální chemie připravit knihovny nových derivátů. Pokud se nám tento záměr podaří, bude postup zejména užitečný při zkoumání vlivu různých substituentů na biologickou aktivitu a pro přípravy setů prodrugs.
  4. Zkoumání mechanizmů biologických aktivit a molekulárních cílů. Toto je asi nejdůležitějším cílem našich pracovišť. Znalost molekulárního cíle nebo cílů by nám velmi usnadnila provádění in silico strukturně-aktivitních předpovědí a to by následně vedlo k mnohem lepším návrhům struktur ideálních inhibitorů. V současnosti studujeme možnosti využití biotin/streptavidin afinitní chromatografie v tandemu s MALDI TOF hmotnostní spektrometrií. Jedná se o to, že k molekulám terpenu navázaným přes linker k biotinu se přidá lyzát nádorových buňek a nechá inkubovat.  Terpen na sebe naváže molekulový cíl, poté se přidají polystyrenové kuličky pokryté streptavidinem. Dojde k navázání biotinu k streptavidinu silnou nekovalentní interakcí a tím k zakotvení celého komplexu (včetně molekulárního cíle) na pevnou fázi (kuličky). Lyzát je potom odstraněn, pevná fáze je promyta a následně je pufry eluován molekulový cíl. Jeho struktura je identifikována pomocí MALDI TOF. Z tohoto důvodu kotvíme aktivní triterpeny na biotin, zatím se nejvýhodnějším postupem ukazuje proces na pevné fázi analogický k tomu v práci.8
  5. Provádění dalších biologických experimentů. Experimenty jsou prováděny na pracovišti LEM pod vedením doc. Hajdúcha a Dr. Džubáka. U nových derivátů je nejdřív zjištěna cytotoxická aktivita na citlivé nádorové linii T-lymfoblastické leukemie CCRF-CEM a v případě kladného výsledku je pak sloučenina testována na dalších 10-20 nádorových liniích různého histogenetického původu včetně linií nesoucích multi drug resistance fenotyp. Zároveň je studován vliv derivátů na buňečný cyklus a pomocí dalších metod jsou zjišťovány informace o možném mechanizmu účinku (např. analýza přítomnosti specifických RNA). Nejlepší deriváty jsou pak testovány v in vivo experimentech na myších a jsou optimalizovány jejich farmakologické vlastnosti pomocí syntézy prodrugs a jsou hledány vhodné farmakologické formulace pro podání.

Kontakt: milan.urban@orgchem.upol.cz; jan.sarek@gmail.com

Informace pro studenty: Závěrečné práce je možné vykonávat u Dr. Urbana na ÚMTM (viz sekce závěrečné práce pro studenty na webových stránkách KOCH) nebo u Dr. Šarka ve firmě Betulinines (sídlící ve Stříbrné Skalici).  Případní zájemci o práci tam  se dohodnou na podrobnostech tématu a jeho realizace (dojíždění, ubytování apod.) přímo s Dr. Šarkem: 606234503 nebo Info@betulinines.com (témata: Příprava nových lupadienových kyselin a jejich derivátů s cytotoxickou aktivitou; Příprava hdrofilních derivátů betulininů vhodných pro in vivo testování).

Literatura:

  1. Dzubak P., Hajduch M., Vydra D., Hustova A., Kvasnica M., Biedermann D., Markova L., Urban M., Sarek J.: Nat. Prod. Rep. 200623, 394.
  2. Sarek J., Klinot J., Brazinova S., Dzubak P., Klinotova E., Noskova V., Krecek V., Korinkova J., Thomson J. O., Janostakova A., Wang S., Parsons S., Fischer P. M., Zhelev N. Z., Hajduch M.: J. Med. Chem. 200346, 5402.
  3. Urban M., Sarek J., Kvasnica M., Tislerova I., Hajduch M.: J. Nat. Prod. 200770, 526.
  4. Urban M., Vlk M., Dzubak P., Hajduch M., Sarek J.: Bioorg. Med. Chem. 201220, 3666.
  5. Patenty např.: WO200190096-A2; WO200190136-A; WO200190046-A1; WO2010054606-A3.
  6. Chowdhury A. R., Mandal S., Mittra B., Sharma S., Mukhopadhyay S., Majumder H.K.: Med. Sci. Monit. 20028, 254.
  7. Nguyen A. T., Feasley C. L., Jackson K. W., Nitz T. J., Salzwedel K., Gillian M Air G. M., Sakalian M.: Retrovirology 20118, 101.
  8. Cankarova N., Funk P., Hlavac J., Soural M.: Tetrahedron Lett. 2011, 52, 5782.